CLICK HERE FOR BLOGGER TEMPLATES AND MYSPACE LAYOUTS »

Rabu, Juni 24, 2009

langkah kerja membuat preparat kering

Pembuatan preparat histologi pada daun eceng gondok dilakukan beberapa tahapan sesuai dengan petunjuk Sass (1985) sebagai berikut:
1). Fiksasi
Fiksasi jaringan berfungsi untuk mencegah terjadinya perubahan jaringan sehingga tidak mempengaruhi autolisis pasca mati dan meningkatkan daya pewarnaan jaringan. Larutan yang dipakai dalam proses fiksasi adalah FAA dimana organ daun eceng gondok diambil kemudian dipotong dengan lebar 0,5 cm dengan panjang 1 cm secara melintang kemudian dimasukkkan ke dalam larutan FAA selama 48 jam. Kemudian sampel dimasukkan ke dalam casste embeding yang sudah diberi kode dengan menggunakan pensil 2B.
2). Pencucian
Setelah dilakukan fiksasi maka dilakukan pencucian dengan menggunakan alkohol 70 % selama beberapa menit.
3). Dehidrasi
Dehidrasi merupakan langkah awal pada proses pembuatan preparat histologi yang bertujuan untuk mengeluarkan air dan menggantikannya dengan alkohol yang terdapat dalam jaringan daun yang dilakukan dengan cara perendaman. Kemudian sampel diletakkan dalam cassette embedding dan dimasukkkan kedalam alkohol secara bertingkat mulai dari alkohol 70 %, alkohol 80%, alkohol 90% dan alkohol 95% serta alkohol absolut masing-masing selama 2 jam.
4). Penjernihan (clearing)
Penjernihan bertujuan untuk menggantikan tempat alkohol dalam jaringan yang mengalami proses dehidrasi menjelang proses infiltrasi parafin. Adapun tahap proses penjernihan (clearing) sampel dimasukkan ke dalam larutan dibawah ini masing-masing perlakuan dilakukan selama 1 jam yaitu:
1. Alkohol 75 ml : Xylol 25 ml (3:1)
2. Alkohol 50 ml : Xylol 50 ml (1:1)
3. Alkohol 25 ml : Xylol 75 ml (1:3)
4. Xylol I
5. Xylol II
5). Embedding dan pengeblokan
Proses embeding bertujuan untuk menyebarkan parafin ke dalam semua ruangan inter sel bahkan ke dalam sel, sehingga jaringan memiliki konsistensi kuat yang sangat diperlukan dalam proses pemotongan.
Adapun proses embedding dan pengeblokan sebagai berikut:
a. Parafin dicairkan dahulu sampai bening di dalam oven pada suhu 580C kemudian parafin dicampurkan dengan xylol dengan perbandingan 1:1 selama 1 jam.
b. Selanjutnya sampel yang telah direndam dalam xylol parafin I selama 1 jam dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 580C.
c. Kemudian dipindahkan ke faparin I selama 1 jam pada suhu 580C
d. Kemudian dipindahkan ke faparin II selama 1 jam pada suhu 580C
e. Parafin cair dituangkan sedikit ke dalam wadah cetakan sebagai dasar pembuatan blok.
f. Sampel diambil dari tempatnya (parafin II) dan di tata pada tempat pemblokan diatas hot plate dengan menggunakan pinset.
g. Diberi tanda atau keterangan pada masing-masing blok/jaringan agar mudah mengenalinya.
h. Setelah ditata dan blok sudah dingin, dilakukan penempelan blok pada holder/kayu.
i. Parafin blok ditempatkan pada bantalan es agar cepat membeku dan tidak pecah pada saat pemotongan.
j. Pemotongan diawali dengan trimming yaitu mengikis sedikit demi sedikit bagian tepi blok yang tidak terdapat sampel daun dengan tujuan untuk mempermudah pemotongan dengan menggunakan mikrotom. Hasil pemblokkan diletakkkan pada holder sesuai dengan mikrotom. Pemotongan dengan mikrotom dilakukan dengan ketebalan 7ยต. Hasil pemotongan yang menyerupai pita diletakkkan pada permukaan air didalam water bach pada suhu 35-40 0C dengan tujuan agar jaringan mengambang dengan baik. Kemudian potongan jaringan tersebut diangkat dan ditempelkan ke objek glass yang sudah diolesi gliserin albumin.

7. Proses Pewarnaan dan Mounting
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempertajam atau memperjelas berbagai elemen jaringan terutama sel-selnya sehingga dapat diamati dengan mikroskop. Sedangkan mounting maksudnya agar preparat histologi bertahan lama yaitu dengan cara menutup dengan gelas penutup yang telah ditetesi entellen neu. Proses pewarnaan dan mounting dilakukan dengan beberapa tahap. Adapun tahap-tahapnya antara lain sampel dimasukkan ke dalam:
a. Xylol I Selama 30 Menit
b. Xylol II Selama 30 Menit
c. Xylol – Alkohol (1:1) selama 15 Menit
d. Alkohol absolut selama 5 menit
e. Alkohol 95 % selama 5 menit
f. Alkohol 80 % selama 5 menit
g. Alkohol 70 % selama 5 menit
h. Safranin 1 % selama 30 menit
i. Cuci dengan air mengalir selama ± 1 menit
j. Alkohol 70 %, alkohol 80 %, alkohol 95 % selama 1 menit
k. Alkohol absolut selama 1 menit
l. Xylol – alkohol (1:1) selama 1 menit
m. Xylol I selama 1 menit
n. Xylol II selama 1 menit

Terakhir ditutup dengan gelas penutup yanng telah ditetesi entellen neu dan dikeringkan. Selanjutnya dilakukan pengamatan dibawah mikroskop dimulai dari perbesaran rendah (10x4) dan dilanjutkan dengan perbesaran (10x40) dengan kalibrasi 0,0025.

0 komentar: